摘要：目的探讨山茱萸对视*醇转运的调控作用，阐述其治疗干眼症的作用机制，丰富“酸补肝明目”的分子基础。方法60只BALB/c小鼠随机分为6组，每组10只，分别为对照组、模型组、阳性对照（石斛夜光丸2.9g/kg）组及山茱萸低、中、高剂量（12、24、48g/kg）组。采用苯扎氯铵滴眼法诱导干眼症模型小鼠，ig给予不同剂量的山茱萸水煎液，通过检测各组小鼠泪液分泌量、泪膜破裂时间，评价山茱萸水煎剂对干眼症模型小鼠的干预作用。ELISA法检测血清前蛋白（PA）、视*醇结合蛋白（RBP）水平、肝脏中视*醇水平；免疫组织化学法（IHC）及Westernblotting法检测泪腺组织中胞内视*醇结合蛋白（CRBP）及RBP受体（STRA6）的表达水平。结果与对照组比较，模型组小鼠泪液分泌量显著减少，泪膜破裂时间显著缩短（P＜0.01），泪腺组织中CRBP及STRA6蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组小鼠血清PA、RBP及肝脏组织中视*醇水平显著升高（P＜0.01），泪腺组织中CRBP及STRA6蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。结论干眼症发生时，机体伴随视*醇缺乏和转运障碍，而酸味药山茱萸水煎液可以促进视*醇吸收，改善机体视*醇缺乏状态，进而调控其转运过程，这可能是“酸入肝，明目”的分子机制之一。
干眼症，又称结膜干燥症，是多种原因引起的泪液质或量的异常，或泪液动力学异常所导致的泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适等症状的多种疾病的总称[1-2]。视*醇（即维生素A）及其主要衍生物（全反式视*酸和视*醛）能够调控脂肪细胞及肌纤维细胞的分化、迁移、侵袭和增殖，上皮细胞的完整性和功能，类固醇和干扰素的生成以及免疫细胞的功能，尤其对胚胎发育有极其重要的影响[1]。视*醇主要存在于肝脏中，在视*醇结合蛋白（RBP）、血清前蛋白（PA）的参与下，完成在血液中的转运，在RBP受体（STRA6）和胞内视*醇结合蛋白（CRBP）的参与下，完成向细胞内部的转运，从而发挥相应的生物学作用。
中医学认为酸入肝，酸补肝，而肝开窍于目。中医学范畴无干眼症之说，但有“白涩症”的古籍记载，与现代的干眼症极其相似。其发病机制为“阴虚津亏”。而视*醇又存在于肝脏中，故本研究采用酸味中药山茱萸对苯扎氯铵诱导的干眼症模型小鼠进行干预，观察酸味中药对干眼症小鼠视*醇转运的干预作用，揭示“酸补肝明目”的分子机制。
1材料
1.1药材
山茱萸（批号），安徽普仁中药饮片有限公司生产，经辽宁中医药大学药学院尹海波教授鉴定为山茱萸CornusofficinalisSieb.etZucc.正品。
1.2实验动物
SPF级BALB/c小鼠60只，6～8周龄，体质量18～22g，雌雄各半，购自辽宁长生生物科技有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（辽）-。饲养于辽宁中医药大学实验动物中心，实验动物饲养许可证号SYXK（辽）-。适应性饲养1周后开始实验。
1.3药品与试剂
苯扎氯铵购自Sigma公司，批号；石斛夜光丸，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产，批号。PA检测试剂盒、视*醇检测试剂盒、RBP检测试剂盒购于武汉优尔生商贸有限公司；RBP、STRA6抗体购自Abcam公司。
1.4仪器
Antho型酶标仪，奥地利安图公司生产；RM型切片机，德国徕卡公司；SHA-B型恒温水浴振荡器，常州国华仪器厂；EPS型电泳仪，上海天能科技有限公司；4SF型凝胶成像分析系统，上海天能科技有限公司。
2方法
2.1山茱萸水煎液的制备
山茱萸水煎剂的制备参考“中药配方颗粒质量控制与标准”中的制备方法[3]。称取山茱萸饮片g，加8倍量水，浸泡30min，武火煮沸并保持微沸30min，趁热3层纱布滤过，药渣再加6倍量水煎煮20min，趁热滤过，合并2次滤液并水浴加热浓缩，放冷，转移至mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得规格为0.2g/mL的山茱萸饮片传统汤剂。测定莫诺苷和马钱苷质量分数分别为1.68%和0.92%，总质量分数为2.60%，符合《中国药典》年版中总含量高于1.20%的限量要求[4]。以山茱萸传统汤剂为基础进行浓缩，分别浓缩至0.6、1.2、2.4g/mL，4℃保存备用。
2.2分组及模型制备
60只BALB/c小鼠随机分为6组，每组10只。分别为对照组，模型组，阳性对照石斛夜光丸组及山茱萸低、中、高剂量（12、24、48g/kg）组。除对照组外，其余各组小鼠均给予双眼滴苯扎氯铵溶液复制干眼症模型。苯扎氯铵质量浓度为0.2%，滴眼量5μL/眼。每日1次，连续6周。
滴眼6周后，各组小鼠采用泪液测定滤纸测定基础泪液分泌量。采用荧光素染色法观察泪膜破裂时间以评价模型是否成功。
2.3药物干预
模型制备成功后，次日开始，对照组小鼠不作处理，正常饲养。模型组小鼠ig生理盐水0.02mL/g，每日1次，连续4周。阳性对照组ig石斛夜光丸2.9g/kg，每日1次，连续4周。据文献报道[5-6]，以正常成人用量30g为标准，根据小鼠与人等效剂量换算公式进行换算，确定山茱萸低、中、高剂量分别为小鼠与人等效剂量的3、6、12倍，所以给药剂量为12、24、48g/kg。每日1次，连续给药4周。
2.4酶联免疫吸附法检测血清PA、RBP水平
末次给药后，各组小鼠再次测定泪液分泌量和泪膜破裂时间，麻醉，经球后静脉丛采集全血，分离血清，采用酶联免疫吸附（双抗体夹心）法检测血清PA、RBP水平，按照试剂盒说明书操作。
2.5酶联免疫吸附法检测肝脏中视*醇水平
各组小鼠取血后处死，迅速置于冰面上，剖开腹部，采集肝脏组织mg左右，装于1.5mL冻存管中，?80℃保存。采用酶联免疫吸附（竞争抑制）法检测肝脏组织匀浆中视*醇水平，操作步骤按照说明书进行。
2.6IHC法检测泪腺组织中CRBP及STRA6蛋白表达水平
各组小鼠随机选取6只（12眼），以眼科剪及眼科镊摘取左侧眼球后泪腺组织，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，常温固定24h后，制备石蜡切片，采用IHC法检测CRBP及STRA6的表达水平。
常规制备石蜡切片，脱蜡至水，抗原修复并去除内源性过氧化物酶后，封闭1h，一抗（1∶）4℃冰箱孵育过夜，二抗室温孵育2h，DAB显色，并以苏木素复染，镜下观察并采集照片，测定5个随机视野的平均吸光度（A）值，以其均值作为该样本中目的蛋白表达水平，进行统计分析。
2.7Westernblotting法检测泪腺组织中CRBP及STRA6蛋白表达水平
各组小鼠以“2.6”项下方法采集右侧眼球泪腺组织，冷冻保存，采用Westernblotting法检测CRBP及STRA6的表达水平。采用裂解法抽提泪腺组织中总蛋白，蛋白定量后测定蛋白浓度，加入5×上样缓冲液，沸水浴变性5min，以每孔50μg的蛋白量进行上样，并垂直电泳，湿转法将凝胶中蛋白转印至PVDF膜，一抗（1∶）4℃冰箱孵育过夜，二抗室温孵育2h，洗膜后滴加ECL发光液，凝胶成像分析系统中采集图像，并测定条带灰度值，以目的蛋白灰度值与内参条带灰度值的比值作为该蛋白的相对表达水平进行统计分析。
2.8统计学方法
用SPSS16.0软件进行统计学分析，先进行方差的齐性检验，然后采用完全随机设计方差分析（One-wayANOVA法），数据均以表示。组间两两比较采用LSD法。
3结果
3.1山茱萸对干眼症模型小鼠泪液分泌量和泪膜破裂时间的影响
实验结果显示，与对照组比较，模型组小鼠泪液测试滤纸湿润长度显著减少（P＜0.01），泪膜破裂时间显著缩短（P＜0.01），见表1和2。与模型组比较，各药物干预组小鼠泪液测试滤纸湿润长度不同程度增加（P＜0.01），泪膜破裂时间不同程度增加（P＜0.01）。
3.2山茱萸对干眼症模型小鼠血清中PA、RBP水平的影响
各组小鼠血清PA、RBP检测结果显示，与对照组比较，模型组小鼠血清PA、RBP水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，各药物干预组小鼠血清PA、RBP水平显著升高（P＜0.01），见表3。
3.3山茱萸对干眼症模型小鼠肝脏组织视*醇水平的影响
与对照组比较，模型组小鼠肝脏组织视*醇水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，除山茱萸低剂量组，各药物干预组小鼠肝脏组织视*醇水平显著升高（P＜0.01）。与阳性对照组比较，山茱萸低、中剂量组小鼠肝脏组织视*醇水平显著降低（P＜0.01），见表4。
3.4山茱萸对干眼症模型小鼠泪腺组织中CRBP、STRA6表达水平的影响
IHC法检测结果显示，与对照组比较，模型组小鼠泪腺组织中CRBP、STRA6表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，各药物干预组小鼠泪腺组织中CRBP、STRA6表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。与阳性对照组比较，山茱萸高剂量组小鼠泪腺组织中CRBP、STRA6表达水平显著升高（P＜0.01）。见表5与图1。
Westernblotting法检测结果显示，与对照组比较，模型组小鼠泪腺组织中CRBP及STRA6表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，各药物干预组小鼠泪腺组织中CRBP、STRA6表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。与阳性对照组比较，山茱萸高剂量组小鼠泪腺组织中CRBP、STRA6表达水平显著升高（P＜0.05、0.01），见表6与图2。
4讨论
干眼症与视*醇密切相关。肝脏是人体内含视*醇最多的器官，能合成在体内转运视*醇的RBP，在肝功能障碍时肝细胞对其的合成减少，造成血浆视*醇水平降低，导致对弱光敏感性下降，严重时发生夜盲[7]。
视*醇是一类脂溶性的化合物。研究表明，视*醇对角膜上皮细胞具有非常重要的作用，当视*醇缺乏时，杯状细胞化角膜上皮细胞微绒毛减少，从而导致角膜上皮不能正常的生长及分化，而发生角膜上皮角化或鳞化。而视*醇可逆转这一改变，使角膜上皮细胞重新转化为分泌上皮细胞，促进眼表上皮细胞和杯状细胞分泌黏蛋白[8]。因此，视*醇的转运过程在干眼症的发生过程中发挥着至关重要的作用。
视*醇主要存在于肝脏中，当机体组织需要视*醇时，酯酶会将肝脏中的视*醇水解，然后再与RBP及PA结合形成复合体（复合体为水溶性，并且能够被细胞膜识别），并释放至肝脏外，进入血液循环中，运输至靶组织中[9]。视*醇-RBP-PA复合体进入靶组织后，通过RBP与细胞膜上的受体结合，并将视*醇释放至细胞内，RBP即完成使命，从复合体中解离，并发生变性，失去结合到细胞膜受体的能力，经过肾小球滤过和肾小管的重吸收，分解为氨基酸[10]。另一方面，进入靶细胞的视*醇会立即与膜受体结合，然后再与CRBP相结合形成复合体，从而与膜受体分离并转运至胞内[11]。视*醇的转运中，PA、RBP、STRA6发挥了重要作用。最终使视*醇在胞内发挥生物学作用。而视*醇的缺乏会造成上皮组织的干燥，全身各种组织的上皮细胞都会受到影响，受累最早的是眼结膜、角膜和泪腺上皮细胞[12-13]。因此，调控视*醇的转运对干眼症的治疗具有十分重要的意义。
本研究结果显示，苯扎氯铵滴眼6周，小鼠泪液分泌量显著下降，泪膜破裂时间显著缩短，结合以往文献的报道，提示苯扎氯铵诱导的干眼症小鼠模型稳定可靠[14-15]。给予山茱萸水煎剂进行干预后，发现山茱萸能够明显改善苯扎氯铵导致的干眼症状。进一步检测小鼠肝脏组织中的视*醇及血清中PA、RBP，结果发现与对照组比较，模型组小鼠血清PA、RBP水平及肝脏组织中视*醇水平显著降低，而药物干预后，小鼠血清中PA、RBP水平及肝脏组织中视*醇水平显著升高。结果提示，干眼症发生时，机体处于视*醇缺乏状态，同时，因较低水平的视*醇不能有效刺激RBP和PA的分泌，血清PA及RBP表达水平也较低。由此可见，山茱萸对视*醇吸收利用具有促进作用，可能是通过促进视*醇的吸收而实现上调PA和RBP的表达水平，进而加快了视*醇的转运。
泪腺组织中CRBP、STRA6表达水平的检测结果显示，与对照组比较，模型组小鼠泪腺组织中CRBP及STRA6表达水平显著降低，而与模型组比较，各药物干预组小鼠泪腺组织中CRBP、STRA6表达水平不同程度的升高。结果提示，干眼症的发生伴随胞内RBP和其受体的低表达，也就是说干眼症的发生不仅仅是视*醇转运发生了障碍，胞内的转运过程也受到了影响，该影响主要表现为RBP和其受体的表达水平较低[16]。而山茱萸干预后，二者的低表达状态得以纠正，加强了胞内视*醇的转运，从而发挥对泪腺上皮细胞的保护作用，最终实现抗干眼作用。
综上所述，山茱萸通过增加视*醇的吸收及转运而调控视*醇转运相关蛋白的表达，发挥抗干眼作用，为“酸补肝明目”的中医学基础理论奠定了实验依据。
参考文献（略）
来源：陈宇，马贤德，刘昱麟，宫照东，姜开运.山茱萸对苯扎氯铵诱导的干眼症小鼠视*醇转运调控作用研究[J].中草药,,50(14):-.
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