摘要
防腐剂苯扎氯铵（BAC）在眼科溶液中的应用非常普遍，尽管它有可能加剧干眼症（DED），对角膜上皮的影响尚在研究中。已经评估了BAC用于DED小鼠模型的作用，但对对角膜缘上皮细胞的影响的研究仍未深入。我们的研究旨在全面评估不同BAC给药方案的影响及其作为DED小鼠模型的适用性。
方法
C57BL/6J小鼠（n=72）局部接受BAC（0.05–0.2%）超过7天。应用荧光素染色、角膜平滑指数和免疫组织学分析来确定BAC治疗后眼表的结构和细胞变化。使用形态学和功能分析检查了BAC（0.-0.01％）对培养的原代小鼠角膜上皮细胞（CLEC）（n=6）的影响。
结果
0.2％BAC导致严重的角膜上皮缺损，而0.1％BAC在7天内每天使用一次，可诱导点状荧光素染色而不损害角膜平滑度。组织化学染色显示基底角膜上皮细胞排列紊乱，胞质晕增大。PAS+杯状细胞减少。BAC处理也调节K14在角膜缘的表达和分布。在培养的CLEC中，BAC引起细胞收缩和空泡化，使LDH释放增加，细胞坏死增加4.1倍。BAC的浓度低至0.％会降低菌落形成。
结论
本研究描述了C57BL/6小鼠暴露于BAC后，如何诱发人类出现的DED的一些临床病理特征，从而为探讨其对眼表，尤其是角膜上皮及其干细胞的影响提供了基础。
简介
干眼症（DED）是一种多因素的疾病，其病因很多，既有外在因素（如生活方式和环境），也有内在因素（如自身免疫）。DED包括一种或多种泪液成分的功能障碍，导致泪膜不稳定，以及无法保护和维持眼表和导致慢性炎症。眼部刺激，刺痛和异物感是患者经常报告的症状，使用含有防腐剂（如苯扎氯铵（BAC））的局部滴眼剂会使病情恶化。BAC是一种季铵阳离子，广泛用于保存眼科制剂，有两个主要用途。首先，它作为一种表面活性剂将离子组分溶解到其他不相容的溶剂中。这促进了药物的有效乳化和稳定，因此延长了保质期。其次，BAC在抑制微生物活性方面优于其他防腐剂。近年来，BAC成为研究动物模型中DED发病机理的药物。兔试验显示，在4-14天中每天两次局部应用0.1％BAC，导致DED的发展。小鼠试验显示，0.2%的BAC每天两次的应用会触发DED的临床症状，包括荧光素染色增加、角膜不规则和结膜杯状细胞（GCs）丢失。大多数研究BAC的小鼠研究都是BALB/c品系，但是观察到了品系特异性反应。
值得注意的是，以更高的频率使用0.2％的BAC时会出现严重的眼表疾病（例如角膜缘干细胞缺乏症）。尚不清楚DED动物模型中眼表对BAC的反应机制。尽管研究人员已经检查了该模型的角膜上皮细胞，但是关于它对角膜缘上皮细胞（CLECs）影响的信息很少。当然，已经在多种物种中研究了BAC对培养的角膜和结膜细胞的*性作用。BAC诱导细胞损伤和凋亡，抑制细胞迁移。有趣的是，低浓度BAC会导致DNA链断裂和线粒体功能障碍。此外，在新外用药物的监管批准程序中进行的细胞*性试验，通常不以反映眼药水持续多次使用的方式进行。因此，这些测试无法筛查长期暴露下的累积*性。研究人员使用各种体外和体内方法研究DED的过程中，记录了细胞增殖，凋亡，屏障功能和GC数量的变化，但是否影响角膜缘上皮细胞的细节披露很少。因此，我们推测急性BAC暴露会给CLEC动态带来短暂的改变。本文发现0.1％BAC诱导上皮损伤，类似于C57BL/6小鼠中DED的特征，包括角膜通透性增加，GC损失和角膜上皮应激。此外，BAC刺激角膜中央和外周上皮细胞增殖，并使角蛋白14（K14）+细胞从角膜缘向周围角膜移动。将原代小鼠CLEC暴露于BAC会引起细胞坏死和干细胞功能丧失。
小鼠干眼症模型
使用异氟烷将7-8周龄的雌性C57BL/6小鼠（n=48）固定15秒，并局部以5μl液滴的形式将BAC注入右眼连续7天通过微量移液器进行给药，每天一次或在每天两次。随机分为4组，分别为0%（PBS对照组）、0.05%、0.1%和0.2%BAC。左眼未经治疗。一旦在雌性小鼠中发现了具有类似DED特征的BAC浓度，便以相同的浓度对7-8周龄的雄性小鼠（n=12）进行给予BAC。
荧光素渗透性和角膜光滑度
腹腔注射氯胺酮和二甲苯嗪（分别为mg/kg和10mg/kg）麻醉小鼠，然后滴入1μl0.1%荧光素钠。小鼠被手动眨三下眼睛来分配染料，然后闭上眼睛，去掉多余的染料。用钴蓝滤光片，用尼康FS-3眼科裂隙灯对每只眼睛进行检查和成像。将角膜图像分为五个部分（鼻部、颞部、上部、下部和中部），每个部分都使用之前经过验证的小鼠评分系统进行评分。0=无染色，1=轻微点状染色，2=明显点状或轻微合并染色，3=明显合并或轻微斑片状染色，4=明显斑片状染色。图像由一名实验者和两名独立的观察者评分。角膜平滑度是使用先前公布的方法以定义的5点量表确定的。
组织学和形态计量学评价
对小鼠连续给药BAC7天后，对小鼠实施安乐死，将包括角膜，结膜和眼睑的眼表全部切除，固定在10％福尔马林中，并石蜡包埋以进行切片。从三个指定位置收集矢状切面（5μm），每个位置间隔约μm，以横向方向覆盖眼表。用HE和PAS染色代表性切片，观察和评价GC形态和数量。通过计数结膜上皮内的PAS+细胞来测量GC密度。用配备OlympusDP73数码相机的OlympusBX51显微镜拍摄图像，然后使用适当的软件对其进行分析。
免疫荧光染色
切片在Tris缓冲盐水（TBS，pH7.6）中平衡20分钟，在TBS中用0.1M甘氨酸淬火30分钟，然后在室温下用20%山羊或兔血清室温下封闭1小时。将切片从封闭溶液中取出与一抗（在TBS-B中稀释）在4°C孵育过夜。以预定浓度使用一抗。兔和山羊IgG，或不使用一抗作为试剂阴性对照。然后将切片用TBS冲洗，并与AlexaFluor偶联的二抗反应1小时。将载玻片安装在含有DAPI的ProLongGold?防褪色材料上，并在配备DP73数码相机的OlympusBX51上成像。
原代CLECs细胞培养及BAC的诱导效果
如前所述，小鼠原代细胞在规定的无血清角质形成细胞培养基中增殖。将CLECs以3×细胞/孔的密度接种于24孔培养板中，然后在生长培养基中培养至融合，然后去除培养基，用PBS冲洗细胞三次。将BAC在KSFM（μl/孔）中以10倍极限稀释度（0.1％，0.01％，0.％和0.％）稀释10分钟，将细胞用PBS洗涤三次，并24h替换一次培养基（无BAC）。使用EVOS-FL倒置显微镜捕获图像。在一些实验中，收集条件培养基以检测LDH含量以确定细胞*性。部分细胞经annexinV和碘化丙啶染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。
结果
BAC诱导的小鼠角膜上皮细胞的临床变化
图1：每日给予一次BAC的临床影像学及评分
在指定的时间点，对小鼠的眼睛用荧光素钠染色，然后用裂隙灯显微镜成像。在基线时对角膜上皮进行缺陷分级后，每天一次0％（PBS对照），0.05％和0.1％BAC组的小鼠无明显差异，而接受0.2％BAC的小鼠的基线值略低于对照组。在第4天和第7天，与对照组相比，滴注0.05％BAC后染色也没有明显增加。有趣的是，从第4天到第7天，给予0.1％和0.2％BAC组中的荧光素吸收水平下降。但是，在第7天与对照组相比，给予0.1％和0.2％的BAC后，荧光素的摄取显着增加。在第7天，检查眼睛的角膜平滑度，其中BAC与对照组相比无明显差异。此外，荧光素染色或角膜平滑度无性别相关差异。
图2：每日给予两次BAC的临床影像学及评分
在每天接受两次BAC滴眼的动物也出现了类似的荧光素染色模式，但是这种效果比那些每天滴眼一次BAC的动物染色范围要大。0.05%BAC组荧光素染色与对照组相比无明显变化。与0.1％和0.2％BAC治疗的眼睛明显染色形成对比，后者在第4天和第7天出现了上皮缺损。在第7天，与对照组相比，每天接受两次0.1%和0.2%BAC的小鼠的荧光素得分显著高于对照组。与每日给药一次相似，0.1％组的荧光素染色水平从第4天到第7天下降。每日两次0%和0.05%BAC的小鼠角膜光滑度无明显变化，但0.1%和0.2%BAC对角膜上皮细胞有影响。
BAC诱导小鼠角膜上皮的组织学变化
图3：暴露于BAC后小鼠角膜的组织病理学
连续7天暴露于BAC后摘取角膜，HE染色观察眼组织。接受PBS滴眼的小鼠表现出正常的角膜上皮，并有组织紧密的基底，上基底和浅表鳞屑层。然而，随着BAC浓度的增加，上皮组织和形态发生了微妙的变化。首先，位于基膜上的基底细胞分布较不均匀，大小和形状不规则。其次，在基底细胞和基底上细胞中，细胞核周围的胞质晕更加明显。第三，较高浓度的BAC滴眼后，有丝分裂图证明了基底细胞的增殖。事实上，与对照组相比，0.1%的BAC在中心和周边诱导了显著的基底细胞增殖，而在角膜边缘则没有。
暴露于BAC后结膜杯状细胞形态及表型的测定
图4：暴露于BAC后结膜杯状细胞的组织病理学
每天给予一次和两次BAC对GCs有几种主要的形态学影响。每日给药一次，所有小鼠的GC密度均显著降低，与BAC剂量无关。与对照组相比，0.05％BAC，0.1％BAC和0.2％BAC组的GC密度均下降。每日给予BAC两次，0.1％BAC和0.2％BAC组的小鼠的GC密度明显低于对照组。此外，与对照组相比，每天一次0.1％BAC后可见GC表面积降低了3倍，而每天两次0.1％BAC组GC表面积却降低了6倍。未发现与性别相关的GC密度差异。
体内BAC对K14+CLECs的作用
图5：BAC对K14+CLECs的体内作用
研究0.1%BAC对K14+CLECs的影响。经肉眼观察，BAC处理的角膜中K14+CLECs与对照角膜中的相同细胞相比被分散，其中大多数局限于狭窄的角膜缘弧。在基底层至上基底层和基底上层至浅层的角膜半径“r”以50μm的增量将整合荧光强度分割，显示暴露于BAC后两个间隔中的前50μm显著降低。将数值标准化为每个视野最大强度的比例，然后在μm的“r”范围内进行比较，以评估边缘内部K14的径向分布与对照组相比，BAC处理的角膜内-μm、-μm和-μm区域的荧光信号在统计学上显著增加。
-BAC对小鼠原代CLECs的细胞*性作用
图6：BAC对小鼠原代CLECs的细胞*性作用
与未经处理的细胞相比，暴露于BAC的细胞有明显的形态变化；处理后24小时最明显，细胞呈圆形，颗粒状且不致密实。与对照组细胞形成鲜明对比，对照组细胞具有典型的鹅卵石形态，具有明显的紧密连接。Confetti小鼠的CLEC变化非常明显，它们在不同的亚细胞位置固有表达荧光蛋白。值得注意的是，随着BAC浓度的增加，Confetti小鼠上皮细胞逐渐失去荧光，意味着细胞活性降低。这些结果通过标准化的LDH分析得以证实，与对照组相比，暴露于0.01％BAC的WT和Confetti细胞的细胞*性增加。两种细胞在0.01%BAC暴露后LDH释放量无差异。
结论：本研究描述了C57BL/6小鼠暴露于BAC后，如何诱发人类出现的DED的一些临床病理特征，从而为探讨其对眼表，尤其是角膜上皮及其干细胞的影响提供了基础。
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